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非编码RNA测序研究怎么做?看大牛们的最新成果

发布时间:2019-3-12 15:21:51阅读次数: .html 次分享到:

        非编码RNA(ncRNAs)是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 、microRNA 和lncRNA等多种已知功能的RNA,还包括未知功能的RNA。高等生物多达一半以上的DNA转录为RNA,其中绝大多数为ncRNA。ncRNA在生物发育的过程中,有着不亚于蛋白质的重要作用,彻底弄清ncRNA 的调控网络,将是揭示生命奥秘的最终突破。


    今天,小编以lncRNA + small RNA测序为例,罗列出最新的非编码RNA重磅研究成果,一起来领略大牛们的研究思路是如何凝炼的。



LncRNA研究


        案例一 Combined Single-Cell Profiling of lncRNAs and Functional Screening Reveals that H19 Is Pivotal for Embryonic Hematopoietic Stem Cell Development


        主动脉-性腺-中肾区(AGM)主动脉腹侧的一群特化的血管内皮细胞,可通过内皮-造血转化,历经HSC前体(pre-HSC),最终生成HSC(造血干细胞)。迄今为止,非编码RNA在HSC发育中的动态表达全貌和生理功能仍不清楚。

本研究采用单细胞孵育诱导移植,结合细胞表面标志CD201的特异性高表达,实现了pre-HSC高达30%成功率的高效捕获,同时联合单细胞转录组测序技术,首次描绘出HSC发育全程的lncRNA动态表达图谱,并鉴定到一系列在HSC发育过程中全新未注释的lncRNA分子。深入分析了lncRNA与其邻近基因的表达关系,揭示在HSC发生过程中发挥重要功能的lncRNA,系统阐述了lncRNA-H19在胚胎HSC发生与成体HSC稳态维持中完全不同的功能以及调控方式。这些认识将为全面理解lncRNA调控重要生物学过程的机制提供重要启示,HSC发育全程的单细胞lncRNA图谱也将为HSC发育和再生机制研究提供重要的数据库和参考。




图1 单细胞lncRNA图谱构建及H19作用机制模式图


    参考文献:

    J. Zhou et al., Combined Single-Cell Profiling of lncRNAs and Functional Screening Reveals that H19 Is Pivotal for Embryonic Hematopoietic Stem Cell Development[J]. Cell Stem Cell, 2019.



        案例二 Long non-coding RNAs discriminate the stages and gene regulatory states of human humoral immune response


        lncRNA相比mRNA含量高,种类丰富,现代研究发现lncRNA在细胞分化、发育和免疫系统中起着关键作用。本研究发现人体30%的基因组在参与体液免疫反应中发生转录,其中58%的转录本有表达差异,细胞类型之间的lncRNA系统发育关系比编码基因更显著。获得了原始细胞和GC B细胞的lncRNA图谱,根据染色质特征、DNase超敏性和转录因子定位将lncRNA划分为10个功能类别,从而定义了lncRNA的分类—如增强子RNA (eRNA)、二价染色体lncRNA和CTCF相关lncRNA等。8.6%的常规增强子和36.5%的超增强子中的eRNAs达到转录,并且与参与关键免疫调控通路的编码基因相关,而浆细胞具有特定的高水平的环状RNA,这些环状RNA的表达与免疫球蛋白的位点克隆状态相关。



图2 人体体液免疫B细胞非编码RNA表达谱



        参考文献:

        Agirre X,Meydan C et al., Long non-coding RNAs discriminate the stages and gene regulatory states of human humoral immune response [J]. Nat Commun, 2019.




Small RNA研究


      案例一  Single-cell microRNA-mRNA co-sequencing reveals non-genetic heterogeneity and mechanisms of microRNA regulation


      对相同的单个细胞进行多组学图谱鉴定,可以解析发育和疾病中细胞间异质性的分子调控机制。而现有的单细胞组学技术是通过比较单个细胞和大量混合细胞之间的可测量的分子表达来量化细胞间异质性,无法区分这种细胞间异质性是真正的生物异质性还是单细胞测序技术局限造成的。

本研究远用半细胞基因组学方法,在同一个单细胞中实现了microRNA和mRNA的协同测序,产生可独立验证的的成对半细胞microRNA和mRNA表达谱。通过将microRNA表达水平与表型相同的19个单细胞中预测的靶mRNA的表达水平联系起来,观察到靶mRNA与大量表达的microRNA的变化显著负相关。表明单独的microRNA表达变异性可能导致非遗传性细胞间异质性。通过成对microRNA- mrna共表达谱的分析,我们可以进一步推导和验证控制microRNA表达和细胞间变异性的细胞通路调控关系。



图3 单细胞microRNA和mRNA的联合分析策略






图4 成对半细胞的microRNA及mRNA表达谱



    参考文献:

    Wang N, Zheng J et al. Single-cell microRNA-mRNA co-sequencing reveals non-genetic heterogeneity and mechanisms of microRNA regulation[J]. Nature Communications, 2019, 10(1):95.


        案例二 MiR-135 suppresses glycolysis and promotes pancreatic cancer cell adaptation to metabolic stress by targeting phosphofructokinase-1


        胰腺导管腺癌(PDAC)是人类最致命的癌症之一。胰腺癌细胞可在营养不良的环境中迅速繁殖,而它们适应营养不良条件的代谢应激机制却知之甚少。本研究发现,和邻近的正常组织相比,PDAC患者的miRNA-135明显增加。在谷氨酰胺匮乏的情况下,突变体p53的活性氧依赖激活,直接促进miR-135的表达,导致miR-135的特异性积累。miRNA-135通过靶向磷酸果糖激酶-1抑制有氧糖酵解,促使葡萄糖进入三羧酸循环,从而促进胰腺癌细胞对代谢应激的适应。同样,miR-135沉默可抑制体内肿瘤生长。该研究确定了PDAC细胞在营养不良的微环境中生存的机制,同时也为突变体p53和miRNA在胰腺癌细胞适应代谢应激中的作用提供了见解。




图5 PDAC细胞中miR-135的沉默抑制肿瘤生长



    参考文献:

    Yang Y, Ishak Gabra et al. MiR-135 suppresses glycolysis and promotes pancreatic cancer cell adaptation to metabolic stress by targeting phosphofructokinase-1[J].Nature Communications, 2019


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